酶产品的常见问题及解答

1.常用酶的标准底物以及相关代谢工具

酶	标准底物	肝微粒体	S9	Liver cytosol
CYP1A2	Phenacetin	+	+
CYP2B6	Bupropion	+	+
CYP2C8	Amodiaquine	+	+
CYP2C9	Diclofenac	+	+
CYP2C19	S-Mephenytoin	+	+
CYP2D6	Dextromethorphan	+	+
CYP2E1	Chlorzoxazone	+	+
Glutathione Transferase (GST)	1-chloro-2,4-dintrobenzene		+
Sulfurotrnasferase (SULT)	7-hydroxycoumarin		+	+
Uridine Glucuronide Transferase (UGT)	7-hydroxycoumarin	+	+
Aldehyde Oxidase	Phthalazine		+	+

“+”表示存在。“空白”表示微量或不存在。

2.贴壁肝细胞与悬浮肝细胞的区别？
答：贴壁细胞能够在铺了胶原的培养板上形成贴壁层，在换液操作时能够保留在培养板的孔内。主要适用于需要多次换液，较长时间培养的试验，如诱导，转运体，HBV感染等。悬浮细胞是没有贴壁能力的细胞，适合短时间实验（小于5小时），如代谢稳定性，代谢产物鉴定，肝细胞摄取等试验。

3.肝细胞解冻操作步骤？
答：原代肝细胞在解冻时采取快融的策略。用镊子等工具从液氮中拿出细胞后要首先在空气中放置几秒钟让液氮挥发，防止骤然升温造成液氮喷出伤人或管壁裂开。再放入37°C中水浴约70-90秒，观察到冻存管内的细胞将要化冻还没有成为液体时停止水浴最佳。IVT原代贴壁肝细胞无需离心处理，直接加入到plating media铺板即可。

4.该如何在肝细胞或微粒体中选择体外代谢工具？
答：药物通过肝细胞色素P450代谢是其主要的代谢途径。微粒体含有全部CYP代谢酶能够良好地预测体内代谢的情况，方便试验与购买，是体外代谢研究的首选工具。肝细胞因其具有完全的细胞代谢功能，可以做微粒体代谢的补充。但是在做需要完全细胞生理功能的试验（如诱导，转运体等）时需要选择肝细胞作为研究工具，是微粒体所不能替代的。

5.供体数和酶活不同的微粒体怎么选择？
答：为消除试验材料的个体差异，将多供体混合在一起。参考FDA指导原则，在相关性分析法研究药物代谢表型时可以选择10个不同的供体进行试验，所以在一般的代谢或抑制试验中可以选择10个以上供体的微粒体均可进行研究。
另外，做代谢稳定性（Stability）实验以及代谢产物鉴定（MedID）实验，推荐使用高酶活（H-class）的微粒体，做CYP450抑制实验，建议用普通酶活的微粒体。

6.微粒体如何进行分装保存？
答：微粒体一次实验用不完需要分装保存的，建议化冻时候不要稀释，直接将原液在冰上进行分装，将不用的部分写好标签冻存在-80°C冰箱中。

7.微粒体能冻融多少次？
答：微粒体一般冻融5次以内不影响质量。

8.重组酶有高活性和低活性的有什么区别？实验时该如何选择？
答：高活性的重组酶代谢速率较大，一般在较短的时间内（如10min）代谢速率与孵育时间成线性。低活性重组酶在较长时间内（如1h）具有良好的代谢速率与孵育时间成线性。低活性的重组酶更接近体内环境。

9.重组酶有+B5的，有不加b5的，有什么区别？
答：微粒体上天然水平的CYP 亚酶，在生理状态下发生催化作用时伴随生理水平的细胞色素b5，以及NADPH-CYP 还原酶的辅助。为模拟生理状态，在克隆代谢酶亚基因时会考虑同时克隆细胞色素b5 和还原酶。这并不是发生催化反应的必需条件，且不影响实验结论。

10.培养液保质期多久？加了抗生素以后？
答：培养液在4°C冰箱中可以放3个月。加入抗生素后货架期为7天。

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11.FDA指导原则要求做哪些转运体？试验方案设计策略如何？
答：FDA指导原则规定的转运体包含：肠外排ABC转运体MDR1，BCRP，肝SLC转运体OATP1B1，OATP1B3，以及肾SLC转运体OAT1，OAT3和OCT2这7个转运体。在试验设计上转运体的抑制试验和底物试验都需要进行研究。进行抑制试验，以评估原研药对已经上市的药物的影响；进行底物研究以评估上市药物对原研药的影响。可优先进行抑制试验。

12.代谢表型中设计原则？亚酶贡献度计算方法？
答：代谢表型研究目前主要有4中鉴定方法，即相关性分析法、化学抑制法、抗体抑制法和重组酶法。用化学抑制法和重组酶法相结合比较好的选择。在化学法定性处参与代谢的亚酶后，用相应的重组酶进行验证，并进行亚酶贡献度计算。测定重组酶亚型对微粒体代谢候选药物的贡献率主要有重组酶丰度法、酶动力学法、单抗抑制法、相对活性因子（RAF法）和系统间外推因子法（ISEF），最得到公认的是RAF和ISEF法。

13.诱导实验mRNA 与催化活性在诱导结论上不一致怎么办？
答：mRNA是FDA指导原则（2012版）和CFDA指导原则（2014版）最新规定的检测体外诱导实验的指标，且在FDA指导原则中是唯一指标。目前阶段应当以 mRNA 的数据做最后结论，催化活性指标作为重要参考。

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