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体内/体外实验设计中抑制剂的添加

ED50,Ki50,IC50,Kd50和pIC50各指什么?它们有什么区别
药理和生化研究中,以下一些术语常常被用来描述药物或抑制剂的功效;有时如果研究者没有弄清 原文献作者使用的术语的确切含义,在重复这些实验时会产生困扰。 EC50值:药物达到最大临床功效(有时是抑制或刺激效果)50%时的浓度。这是一个药用术语。 ED50值:50%的个体表现特定药效时药物的有效剂量(而非浓度)。
IC50值: 达到50%抑制效果时抑制剂的浓度。
Ki50值: 检测到50%抑制效果时的抑制剂的浓度(采用Michaelis-Menten动力学计算而获得)。
Kd50值:二个或更多生物分子组成的复合物分离成组分时的平衡常数;例如,抑制剂或底物从酶分离时的pIC50值。
pIC50值:IC50值的10的负对数。

2. 体外实验中需要加多少抑制剂?
通常建议客户参考同模型实验发表的文献报道;
除参考文献报道以外,还需要通过预实验做“剂量-效应曲线”确定最佳作用浓度(浓度梯度);通过“时间-效应曲线”确定最佳孵育时间(处理时间梯度)。
另外,抑制剂的使用量受多种因素影响,包括抑制对象的可接触性,细胞通透性,孵育时间,细胞种类等等。我们建议通过检索文献确定使用抑制剂的起始浓度。如果有报道的Ki值或IC50值,可以采用其5-10 倍的量开始尝试以达到抑制酶活性的最佳效果。如果抑制剂的Ki值或IC50值未知,则需要在更广泛的范围尝试抑制剂的使用浓度,并采用Michaelis-Menten动力学计算Ki值。一般设立溶解抑制剂时所采用的溶剂作为对照,以排除溶剂的非特异性影响。

3. 体内实验时需要注射多少抑制剂或者刺激药物呢?
需要通过一些经验性的预实验来获得试剂的优化剂量。首要考虑是这种试剂必须具备细胞穿透性。检索报道过的IC50值,ED50值或EC50值也非常必要。以下介绍一个抑制剂用量的常用估算方法:
注射量(μg)=IC50(nM)×5~10×分子量×体重(g)×体液占体重的百分数(%)×10-6
以H-89(一种二氢氯化物)为例。这是一种细胞穿透性蛋白激酶A抑制剂,IC50值为48nM,分子量是 519.3,240-480nM可以产生足够的蛋白激酶A的抑制效果。活体(in vivo)实验时我们还需要做一些估算。假定一只200g的大鼠含水量为70%,则抑制剂约在140ml中分布;这样240nM =240nmoles/L= 124.63μg/L。抑制剂溶于140ml,即124.63×0.140 = 17.45μg,所以这只200g的大鼠需要注射的剂量为17.45μg。
同时,抑制剂在体内的实际分布与注射方式(静脉注射,肌肉注射还是腹腔注射?) 药物利用率,半衰期,肝肾清除率,与蛋白的结合,组织特异性分布与富集等等紧密相关。特定组织或器官吸收抑制剂的量也往往比分离的细胞吸收量少。在整个活的动物体上的研究,常常要求抑制剂达到一定的目标浓度的负荷剂量,因此也需要通过持续给药以保持血液中相应的抑制剂浓度。做这类实验必须特别小心,以免在动物上用药过量。

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